Holmes đề xuất thành lập một công ty với giáo sư Robertson vào mùa thu 2003, khi bà chỉ mới 19 tuổi bắt đầu học tại Stanford. Cô đã dùng tiền mà cha mẹ để dành cho đi học, để mở doanh nghiệp Real-Time Cures ở Palo Alto. Sau đó, cô đổi tên công ty thành Theranos (phối hợp chữ "therapy" và "diagnosis"), bởi vì cô tin rằng nhiều người có thành kiến với chữ "cure" (chữa bệnh).[10] Khởi đầu, cô làm việc dưới hầm một nhà đại học.[11] Một khóa học sau đó, cô bỏ học để có thể dành hết thì giờ cho doanh nghiệp của mình. Giáo sư Robertson thì cũng làm giám đốc cho hãng.

Trong vòng 10 năm, công ty phát triển dần dần, được hùn vốn $400 triệu chỉ riêng Draper Fisher Jurvetson và Larry Ellison. Trong thời gian này, Theranos hoạt động kín đáo, giữ bí mật để tránh bị cạnh tranh và tránh bị những nhà đầu tư có thể góp tiền cho một kẻ cạnh tranh. Trong năm 2007, hãng đã đưa ba nhân viên cũ ra tòa, buộc tội họ đã không giữ bí mật doanh nghiệp.

Tới năm 2014, hãng có 500 nhân viên và trị giá hơn $9 tỷ. Holmes giữ kiểm soát hơn 50% phần của công ty.[12]

Trong năm 2014, Holmes có 18 bằng sáng chế Hoa Kỳ và 66 bằng khác đứng tên cô.[10] Holmes là nữ doanh nghiệp tỷ phú trẻ nhất tự kiếm tiền trong danh sách Forbes 400, nơi bà đứng hạng 111; với tài sản là $4.5 tỷ.[1]

Tuy nhiên, trong tháng 10 năm 2015, một bài viết trên tờ Wall Street Journal nảy sinh những nghi ngờ đầu tiên về hiệu quả của các xét nghiệm máu.[13] Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã vào cuộc điều tra. Theo một bài báo của The Wall Street Journal vào tháng 5/2016, Theranos buộc phải hủy hàng nghìn xét nghiệm.[14]

Vào tháng 6 năm 2016, tạp chí Forbes ước tính giá trị của công ty Theranos chỉ khoảng 800 triệu đô la Mỹ và sửa chữa ước tính tài sản Holmes về hầu như bằng không bởi vì tuy Holmes giữ 50% cổ phiếu công ty nhưng không phải là cổ phiếu ưu đãi, do đó trong trường hợp công ty phải thanh lý hoặc phá sản, tài sản của Holmes sẽ không còn gì.[15][16][17]